Dag 4

Både PCR med gelelektrofores och Southern Blot har nu utförts och båda resultaten visade att LL-37 genen fanns i plasmidlösningen. Southern tog väldigt lång tid att göra jämfört med PCR och många fler steg utförs. De olika stegen under Southern tog även väldigt lång tid så det blev väldigt mycket sitta och vänta. När Southern utfördes hade vi en klyvd med koncentrationen 0,5 ng och en med 0,005 ng och när elektroforesen hade utförts och fotats så kunde inte 0,005 ng synas på fotot men när southern var klar så visades ett band som då är LL-37 på membranet och alltså är den metoden känsligare för den kan detektera mindre koncentrationer. Eftersom att Southern har så många fler steg än PCR så kan det finnas en risk att något kan gå fel under något av stegen men Southern är nog ganska säker ändå om man gör allt på rätt sätt.

PCR går betydligt fortare att göra men det finns en risk med carry over kontamination där LL-37 genen kan komma in i röret på annat sätt och sedan ge ett falskt positivt svar. Det är ju även större risk för detta när så många laborerar samtidigt.

Under dessa dagar så har jag lärt mig hur en Southern Blot utförs. Man ska inte heller vara för snabb med att utföra momenten utan ta det i sin takt och tänk efter noggrant vad man gör och kontrollera saker som ska användas tex kammen när brunnar till gelen ska göras.

Dag 2


Dag 2 så utfördes PCR, kontrollelektrofores och klyning av plasmid.
PCR gjordes för att amplifiera LL-37 genen och sedan gjordes en PCR för att kontrollera om genen fanns. Därefter gjordes en klyning för att separera inserten från vektorn.

Första gelen som gjordes blev brunnarna för små och detta gjorde att inget kunde vandra genom gelen och inget resultat kunde tydas. En ny gel gjordes men utan plasmidprep.


 Bild 1 första brunnen från vänster visar markör IX, nästa visar positiv kontroll, tredje visar negativ  kontroll och sista är PCR produkt

Resultatet av gelelektroforesen blev bra och tillförlitlig eftersom att det negativa provet inte visar något band och alltså finns ingen carry-over kontamination. PCR-provet visar ett band lite under 603 baspar och detta är då LL-37 genen som ligger på ca 550 bp. Den positiva kontrollen har däremot vandrat för långt och det kan bero på att den hade väldigt hög koncentration. Annars skulle den också ha ett band vid ca 550 bp så den postiva är inte tillförlitlig.

Till nästa gelelektrofores ska jag tänka på att kammen ska vara rätt justerad så att brunnarna blir tillräckligt djupa. Något annat jag har tänkt på är att inte ha positiv och negativ kontroll bredvid varandra eftersom att det kanske kan hamna positiv kontroll i den negativa som då inte är till någon nytta.

 Dag 1

Under laborationens första dag har jag renat ut rekombinanta plasmider från bakterien e.coli. Plasmiden ska innehålla genen LL-37 men det får vi se senare under laborationen.

Vilka föroreningar har du förhoppningsvis tagit bort?
 Förhoppningsvis har jag renat bort bakteriens kromosomala DNA, RNA, proteiner och andra organeller som finns i bakterien. Efter reningen hoppas jag att endast plasmider finns kvar.

Vad vet du om resultatet? Fick du ren plasmid?
 För att kontrollera om det finns eventuella proteiner i plasmidlösningen lästes absorbansvärdena av i spektrofotometer vid A260 och A280 och räknades ut. En ren plasmidlösning ska ge ett värde mellan 1,8 och 1,9 om man tar kvoten av absorbansvärdena. Får man värden mellan dessa sifffror behöver det inte heller betyda att det är ren plasmidlösning därför var värden mellan 1,6 och 2,0 även godtagliga. jag fick ett värde på 1,9 och koncentration på 0,295 µg/µL och hoppas på att det är en ganska ren plasmidlösning men det vet man inte säkert.

Är det något du funderar på som du vill att vi tar upp vid genomgång nästa labdag eller vid labuppföljningen?
Nej